ddPCR如何实现“单分子级”检测？

ddPCR的核心在于将样本分割成数万个独立的微液滴，每个液滴相当于一个微小的反应体系。

在PCR扩增过程中，如果液滴中存在靶标核酸，扩增后会产生荧光信号，被标记为“阳性”液滴；反之则为“阴性”液滴。

通过统计阴阳性液滴的比例，并结合泊松分布公式，可以直接计算出原始样本中的靶标拷贝数，实现无需标准曲线的绝对定量。

这一技术的实现依赖于精密的仪器设计和严格的性能控制。

微滴生成是ddPCR的第一步，也是最关键的环节之一。

微液滴的体积均一性直接影响检测结果的准确性，通常要求液滴数量达到10,000个以上，且体积CV值控制在5%以内。

此外，模板的随机分布也至关重要，单一拷贝模板的占比需达到90%以上，以确保低频突变的可靠检出。

在PCR扩增阶段，温度控制的精确性同样不可忽视。

ddPCR通常要求升降温速率达到3℃/秒以上，温度均匀性控制在±0.3℃以内，以避免扩增效率的差异导至假阴性结果。

而在光学检测环节，荧光信号的识别能力决定了检测的灵敏度。

高灵敏度的荧光检测系统需要具备低背景噪声、高信噪比的特点，以确保低浓度样本（如0.01%突变频率）的可靠检出。

最终，数据分析算法将决定ddPCR的检测上限。

通过图像分割和信号分类算法，系统需要准确区分真实荧光信号与背景噪声，避免假阳性结果的出现。

某些企业通过优化算法，将微滴分类准确率从88%提升至97%，显著提高了检测的可靠性。